Predisposizione genetica al mesotelioma pleurico. Ricerca di fattori di rischio genetici nella popolazione di Casale Monferrato

SCHEDA SINTETICA DEL PROGETTO DI RICERCA
FINANZIATO DALLA FONDAZIONE BUZZI UNICEM

CAPO PROGETTO:
Prof.ssa Irma Dianzani

SEDE:
Università di Novara

STATO DEL PROGETTO:
Terminato

SINTESI DELLA RICERCA:
CONTESTO E RAZIONALE 
Il mesotelioma maligno (MM) della pleura è un raro tumore molto aggressivo associato all’esposizione all’amianto. Solo 10% delle persone esposte ad alti livelli di amianto sviluppa il MM. Questo comportamento, insieme al riscontro di aggregazione familiare, suggerisce l’esistenza di una predisposizione genetica, ma la rarità del tumore ha finora impedito studi genetici su larga scala (Neri et la 2008; Ugolini et al. 2008). Si ritiene che le fibre di amianto siano cancerogene tramite differenti meccanismi: 
1) effetti meccanici, quali l’interferenza con la formazione del fuso mitotico e la segregazione dei cromosomi; 
2) generazione di specie reattive dell’ossigeno o dalla stessa superficie delle fibre a seguito di reazioni che coinvolgono il ferro come catalizzatore o per effetto della fagocitosi frustrata; 3) effetti locali di attivazione di vie di segnalazione intracellulare (effetto promovente). 
Le conseguenze del danno ossidativo includono rotture del filamento di DNA e modificazioni delle basi (Jensen, et al 1996; Kamp, et al 1999; Wang et al 1998; Yang,  et al. 2006).

Da alcuni anni ci siamo proposti di valutare il ruolo della suscettibilità genetica nello sviluppo del MM. Abbiamo progettato uno studio di associazione con polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) in individui con MM e controlli. Una prima casistica è costituita da persone provenienti da Casale Monferrato, città ad elevato rischio ambientale per l’esistenza di un amianto-cementificio attivo fino al 1986 (Magnani et al. 2001). Si tratta di uno studio caso-controllo: i pazienti e i controlli sono tutti residenti a Casale Monferrato e nelle aree circostanti. Poiché la città non è mai stata soggetta a intensa immigrazione, riteniamo che si tratti di una popolazione relativamente omogenea. Lo studio, proseguito nel corso degli anni, ha finora condotto alla raccolta di 151 pazienti e 252 controlli. I controlli sono stati reclutati dalle liste degli iscritti al Sistema Sanitario Nazionale. Sia i casi sia i controlli sono stati intervistati da un’esperta epidemiologa e la loro esposizione all’amianto è stata accuratamente valutata da un igienista industriale. Uno studio analogo è stato avviato anche a Torino in collaborazione con il Dr Dario Mirabelli ed ha portato finora alla raccolta di 100 pazienti e 60 controlli. In questo caso sono stati scelti controlli ospedalieri, cioè persone ricoverate in ospedale per causa non neoplastica.

Per incrementare ulteriormente la casistica abbiamo inoltre avviato una collaborazione con il gruppo del Dr Stefano Bonassi di Roma e della Dr.ssa Donatella Ugolini dell’ISTGE, che ha fornito una casistica di 100 pazienti e 100 controlli genovesi. 
Infine, è stata avviata una collaborazione con il Dr Hirvonen che ha fornito 100 pazienti e 100 controlli finlandesi. 
In totale abbiamo raccolto 451 pazienti e 512 controlli. In ognuna delle quattro casistiche è stata accuratamente valutata l’esposizione all’amianto.
Abbiamo avviato lo studio con una strategia mirata all’analisi di SNPs in geni in cui poteva essere ipotizzabile un ruolo nella cancerogenesi da amianto (geni coinvolti nel DNA repair, nel controllo dello stato redox della cellula, nell’infiammazione). Gli SNPs sono stati selezionati in base alle seguenti considerazioni: a) alcuni polimorfismi erano già stati associati ad alterazioni funzionali in altri studi; b) gli SNPs conducevano a sostituzioni non conservative localizzate in domini importanti per la funzione della proteina oppure facevano supporre un’alterazione del meccanismo di splicing o della trascrizione. 
E’ stato valutato singolarmente il genotipo composito di ciascun individuo.

Un nostro studio preliminare, effettuato su 81 pazienti e 110 controlli di Casale (finanziato dalla Regione Piemonte), ha mostrato un’associazione tra XRCC1 399Q e MM (Dianzani et al. 2006). In seguito abbiamo confermato tale associazione in una casistica più estesa di Casale Monf.to (133 casi, 182 controlli; incremento degli alleli mutanti: OR=1.46; 95%IC 1.01-2.12) (Betti et al. lavoro in revisione). In un altro studio abbiamo voluto valutare l’eventuale associazione tra il MM e il gene NAT2, che codifica per l’N-acetil-transferasi 2. Uno studio finlandese aveva osservato un’associazione con il fenotipo acetilatore lento, mentre uno studio italiano aveva osservato un’associazione con il fenotipo acetilatore rapido. Abbiamo studiato una casistica costituita da 252 pazienti e 262 controlli, reclutati a Casale Monferrato ed in Liguria. Il fenotipo acetilatore rapido ha mostrato un OR aumentato, seppure non statisticamente significativo sia nei soggetti esposti all’amianto (OR=1.47; 95%IC 0.96–2.26) sia nell’intera popolazione (OR=1.38; 95%IC 0.93–2.04). Questi dati mostrano che questo fenotipo non riveste un ruolo importante nella patogenesi del MM (Betti et al. 2009).

OBIETTIVI E RISULTATI
Il primo livello di studio è stato quello di valutare i risultati ottenuti precedentemente in una casistica più estesa e di ampliare il numero di SNPs in studio. Abbiamo studiato 35 SNPs localizzati in 15 geni per cui si potesse supporre un coinvolgimento nella patogenesi del mesotelioma. I geni in studio sono coinvolti: nel restauro del DNA (XRCC1, XRCC3, ERCC1, ERCC2, OGG1, PARP, PCNA, MGMT, APEX, NBS1), nel controllo dello stato redox (GPX1, SOD2), nell’ infiammazione (OPN), un gene per la fosfatasi 1 (RAI) e SEP15, un gene down-regolato in cellule di mesotelioma. Quattro dei geni sopra elencati erano già stati studiati nel lavoro precedente (Dianzani et al. 2006).
Gli SNPs sono stati analizzati nella casistica di Casale Monf.to (151 pazienti e 252 controlli) e in una prima casistica di Torino (69 pazienti e 44 controlli). 
I risultati attuali confermano un ruolo possibile di XRCC1 399Q e di XRCC1 -77T come fattore di rischio per il MM. Nei soggetti esposti all’amianto l’incremento degli alleli Q mostra un OR=1.44; 95%IC 1.02–2.03 e l’incremento degli alleli T (da eterozigote a omozigote) mostra un OR=1.3; 95% IC 0.98–1.8. Anche l’aplotipo che include questi due SNPs risulta associato al MM (OR=1.76; 95% IC 1.04–2.96). 
Poiché è noto che i due SNPs sopra menzionati possono modificare rispettivamente la struttura tridimensionale e l’espressione quantitativa della proteina XRCC1 è possibile ipotizzare un meccanismo patogenetico alla base dell’associazione con MM.
Un’associazione è stata riscontrata anche per il gene ERCC1, che si trova in una regione adiacente a XRCC1 sul cromosoma 19q13.2. Sia XRCC1 che ERCC1 sono geni coinvolti nel restauro del DNA. 
Tutti gli altri SNP non mostrano un OR statisticamente significativo. 
Il lavoro che riporta questi dati è stato inviato alla rivista Mutation Research che ha chiesto alcune piccole modifiche ed è attualmente in corso di revisione (Betti et al. lavoro in revisione).
La seconda parte del progetto finanziato dall’AIRC, dalla Regione Piemonte e dalla Fondazione Buzzi era rivolto all’identificazione sistematica di tutti i fattori di rischio per lo sviluppo del MM (Genome Wide Association Study-GWAS) utilizzando i microarray della ditta Illumina adatti all’analisi di tutto il genoma. Molti studi hanno individuato fattori di rischio per altri tipi di tumori, utilizzando questa strategia (Rothman et al. 2010). A tale scopo, abbiamo avviato una collaborazione con il Prof. Giuseppe Matullo di Torino che possiede l’apparecchiatura Illumina per l’analisi di SNP. Abbiamo analizzato le casistiche di Casale, Torino e Genova (367 pazienti e 392 controlli) mediante un microarray in grado di interrogare 370.000 varianti genomiche e CNVs (copy number variations). Questo studio ha condotto all’identificazione di 20 SNPs con OR tra 2 e 5 e p≤0.00005 Questi dati devono essere confermati su una casistica indipendente. 

ALTRI FINANZIAMENTI OTTENUTI PER QUESTO PROGETTO
Per lo studio sui geni candidati: Regione Piemonte Ricerca Sanitaria Finalizzata 2006, 2007, 2008 (tutti a I.Dianzani); per il GWAS: Regione Piemonte Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009 (a I.Dianzani), AIRC 2007 (a S.Bonassi).

IMPLICAZIONI "TRANSLAZIONALI" DEL PROGETTO 
L’identificazione dei geni e delle varianti coinvolte permetterà di determinare meglio il rischio di MM da esposizione all’amianto e di meglio chiarirne le basi patogenetiche.

PUBBLICAZIONI:
Dianzani I., Gibello L., Biava A., Giordano M., Bertolotti M., Betti M., Ferrante D., Guarrera S., Betta G.P., Mirabelli D., Matullo G., Magnani C., 2006. Polymorphisms in DNA repair genes as risk factors for asbestos-related malignant mesothelioma in a general population study. Mutat. Res. 599, 124-134.

Neri M., Ugolini D., Dianzani I., Filiberti R., Gemignani F., Landi S., Magnani C., Mutti L., Puntoni R., Bonassi S. 2008 Genetic susceptibility to malignant pleural mesothelioma and other asbestos-related diseases. Mutat. Res. 659, 126-136.

Ugolini D, Neri M, Ceppi M, Cesario A, Dianzani I, Filiberti R, Gemignani F, Landi S, Magnani C, Mutti L, Puntoni R, Bonassi S., 2008 Genetic susceptibility to malignant mesothelioma and exposure to asbestos: The influence of the familial factor. Mutation Research 658, 162–171.

Betti M., Neri M., Ferrante D., S. Landi, Biava A., Gemignani F., Bertolotti M., Mirabelli D., Padoan M.,Ugolini D., Bonassi S., Magnani C., Dianzani I. 2009 Pooled analysis of NAT2 genotypes as risk factors for asbestos-related malignant mesothelioma. Int. J. Hyg. Environ. Health 212, 322-329.

Betti M., Ferrante D., Padoan M., Guarrera S., Giordano M., Aspesi A., Mirabelli D., Casadio C., Ardissone F., Ruffini E., Betta P.G., Libener R., Guaschino R., Matullo G., Piccolini E., Magnani C., Dianzani I. XRCC1 and ERCC1 variants modify malignant mesothelioma risk: A case-control study inviato a Mutation Research in corso di revisione.